微生物检验技术b卷参***及评分标准。
动植物检疫专业2009级2011-2012学年第一学期。
一、填空题(共20分，每空1分)。1.分离纯化与接种技术微生物计数法2.红无。
3.大肠菌群致病菌4.三氯化铁绿色。
5.铜绿假单胞菌大肠埃希菌6.靛基质尿素酶7.链激酶血凝块溶解。
8．血液、血清、腹水乙型（β-溶血链球菌9.副溶血弧菌绿。
10.卵黄琼脂平板琼脂平板。
二、判断题（共10分，每小题1分，用“√”表示对，“×表示错)。1.√2.×3.√4.√5.×6.×7.√8.√9.×10.√
三、名词解释题（共20分，每小题2分)。
1、兰氏分群：兰氏（lancefield)用温热的稀盐酸浸出c抗原，与特异性血清作沉淀反应，将链球菌分为20个血清群（a-v，缺i和j）。
2、暴烈发酵：产气荚膜梭菌牛乳培养基培养时能分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时生成大量气体，将凝固的酪蛋白冲成海棉状碎块。管内气体常将覆盖在液体上的凡士林层向上推挤，这种现象称为“暴烈发酵”。
3、增菌培养基：能够给微生物提供较适当的生长环境从而使微生物大量繁殖的培养基。4、粪大肠菌群：
系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
5、肠杆菌科细菌；是一大群生物学性状近似的革兰氏阴性杆菌。多数是肠道的正常菌群，少数为病原菌。肠杆菌科细菌种类繁多，如埃希菌属、沙门菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属等。
6、类酵母型菌落：外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，它是由伸长的芽生孢子形成，如白色念珠菌。（由于部分单细胞真菌出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离，而形成假菌丝，此假菌丝伸入培养基，形成表面似酵母型菌落、培养基内有假菌丝的类酵母型菌落。
）7、cytopathic effect（cpe）：是指细胞病变效应，病毒在细胞内增殖的结果，常常导致细胞损伤，甚至将其杀死，因而在低倍显微镜下可以看到不同现象，常见的为细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。
8、病毒滴度：样本中病毒的浓度，通过用系列稀释的病毒接种细胞培养、鸡胚或实验动物，检测病毒增殖的情况而确定。可用pfu／ml表示。
9、血凝试验：许多动物病毒，如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成员，能够凝集某些动物(如鸡、小鼠、豚鼠、人)的红细胞。这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质，引起红细胞凝集。
利用这种特性，可做血凝试验来检测这些病毒的存在。
10、中和试验：是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。
四、简答题(共30分，每小题5分)。1、简述真菌毒素的产生条件及检验方法。参***：
真菌毒素的产生条件：①首先取决于菌株，其次依赖于外界环境，如基质、温度和湿度。②基质对霉菌的生长和产毒有一定的影响。
一般而言，真菌产毒菌株主要在食物、粮食、饲草等植物上生长产毒，在乳、蛋等动物源基质上产毒能力较低。③霉菌的生长繁殖与温度有密切关系，大多数最适温度为25~30℃，低于l0℃或高于40℃生长减弱，产毒素能力也会受到影响。④基质的水分、空气的湿度与真菌的生长繁殖和产毒素能力密切相关，基质含水量在17%~18%时为真菌产毒素的最适条件。
(3分)
检测真菌毒素有许多方法：如检测黄曲霉毒素有生物学方法和elisa法等。生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠做毒性试验，观察动物中毒死亡或出现肿瘤。
elisa法操作简便，并具有安全快速高效、费用低，适用于大批量标本的筛选。(2分)
2、简述食品微生物检验的一般流程。参***：
1）样品的采集与送检(1分)
采集的样品必须具有代表性和均匀性，能全面反映被检样品的卫生状况。需要填写采。
样单。样品的送检要求：要快速运送：
不要超过3小时；易变质的样品要冷藏，若路途遥远，无需冷冻样品可保持在1~5℃低温下运送；需保持冷冻状态的样品，可保存在泡沫塑料隔热箱，维持0℃；送检过程，要注意防污染、防散漏、防变质；要填写送检申请单，以供检验人员参考。
2）检验前的准备(1分)①准备好所需的各种仪器。
按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。③准备好所用的各种试剂，制备好普通营养琼脂或其他选择性培养基。④做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min.
⑤工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。
工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。（3）样品的预处理(1分)
不同样品要采用不同的处理方法，均需要在无菌条件下进行操作。（4）常规微生物(1分)
测定细菌的菌落总数和大肠菌群数。
5）致病微生物的检测(1分)
致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。（6）提交检验结果的报告。
3、细胞培养有哪些类型和方法，并比较它们的优缺点？参***：
1)原代细胞培养(1分)
动物组织经胰蛋白酶消化，使细胞分散而得，单个细胞，再生长于培养器皿中。各种组织都能制备，最常用者为肾和**等，胚胎和幼畜的细胞较易生长。
优点：病毒对天然宿主的细胞最易感；适宜于病毒的分离。缺点是有时携带潜伏病毒。
2)二倍体细胞株培养(2分)
原代细胞长成单层后用胰蛋白酶或edta钠将细胞从玻面消化下来，使细胞分散成单个细胞。然后加入新营养液，再分装于玻瓶中长成单层。如此可以连续传代，细胞的染色体数与原组织中一样，仍为二倍体，因此称为二倍体细胞。
优点：细胞碎片较少，潜伏病毒容易发现，对病毒的易感性与原代细胞差别不大。二倍体细胞可以大量培养，将多余细胞在液氮罐中贮存，随时取用，甚为方便。
3)传代细胞系培养(2分)
与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制**下去，有些从肿瘤组织而来，有些从细胞株转化而来。它们的染色体数目常不正常，称为异倍体。
优点：容易培养，生长迅速，传代方便，随时可以获得。
缺点：对病毒分离不够敏感，也不能用此直接制备疫苗，因为接种到动物体内有引起肿瘤的潜在危险。在实验室传代日久，有的可能污染。4、简述病毒感染单位的测定方法。参***：
常用于病毒感染单位测定的技术有空斑试验、终点稀释法、荧光-斑点试验、转化试验等，最常用的是前两种。（1分）
空斑试验是一种检查和准确测定病毒滴度的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。
结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料(如中性红)染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的空斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作空斑形成单位(plaque formingunit, pfu)。
根据样本的稀释度和空斑数，计算每毫升空斑形成单位(pfu),即可确定病毒的滴度。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用pfu／ml表示。（2分）
终点稀释法用于测定几乎所有种类的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。将病毒做系列稀释，选择4~6个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或动物，每个稀释度做3~6个重复。使用细胞培养，可通过cpe来判定组织培养半数感染量(tcid50)。
在鸡胚或动物，是以死亡或发病来测定。以感染发病作为指标时，可计箅半数感染量(id50);以体温反应作为指标时，可计箅半数反应量(rd50)。用鸡胚测定时，可计算鸡胚半数致死量(eld50)或鸡胚半数感染量(eid50)（2分）5、简述溶血试验的原理，写出其试验方法、溶血类型及现象。
参***：
1、原理（2分）
某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。2、试验方法（2分）
1）平板法。
将培养物接种于血平板培养基上，36±1℃培养24～48h，观察结果。溶血试验的溶血类型及现象。
（甲型）溶血：菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。β（乙型）溶血：菌落周围出现较宽的透明溶血环。γ（丙型）溶血：菌落周围无溶血环。（2）试管法。
将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合，在36±1℃培养16～18h，观察结果。如溶血，培养液可出现透明状。3、结果观察与记录（1分）
有溶血现象，为阳性，记+；无溶血现象，为阴性，记-
6、金黄色葡萄球菌有哪些培养特性和生化特性？参***：
1）普通培养基上生长良好，在麦康凯琼脂平板不生长。（1分）（2）血平板上生长更佳，致病菌株β溶血。（1分）（3）产生金黄色色素。（1分）
4）高度耐盐：可在10~15%nacl肉汤中生长。（1分）
5）分解葡、乳、麦、蔗糖，产酸不产气，触酶阳性，致病菌株能分解甘露醇。（1分）
五、问答题(共20分，每小题10分)。
1、详细叙述tsi（triple sugar iron）试验的方法、原理和现象，并分析大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌在tsi琼脂培养基上应该产生何种现象？参***：
1、三糖铁（tsi）试验原理（2分）
三糖铁（tsi）琼脂培养基含有乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁。
2、三糖铁试验的现象（2分）
如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用。
葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色；如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。
3、试验方法（2分）
称取本品64.5g,加热溶解于1000ml蒸馏水中，加热煮沸1分钟，分装于16mm×150mm试管，121℃高压灭菌15分钟制成斜面长4-5cm,底部长2-3cm。以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。
4、志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生h2s，培养基斜面为红色，下部为黄色。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生h2s，培养基全部变黄，底部被抬高。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生h2s，多数产气，培养基底部变黑。
4分）2、描述新生隐球菌的微生物学特性，检验过程采用哪些方法？参***：
微生物学特性：在组织中呈圆形或卵圆形，直径一般在4～6μm，外周有宽厚荚膜，荚膜较菌大1～3倍，折光性强，一般染色法不易着色而难以发现而得名。常采用墨汁负染色法，在黑色景下可镜检到透亮菌体和宽厚荚膜。
（3分）检验方法：
1)标本直接镜检（1分）
用病人脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便、快速方法。
常规细胞染色可发现隐球菌，但易误诊和漏诊。如用pas染色后新生隐球菌呈红色。(2)抗原检测（1分）
用乳胶凝集试验、elisa、和单克隆抗体法等免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床上的常规诊断方法。(3)核酸检测（1分）
可用痰液、支气管吸出物等标本核酸检测方法有dna探针法、pcr探针法等，用于检测的探针、引物主要选自保守区的重复序列。可检出新生隐球菌，并可区别类型，是新生变种还是格特变种。非致病性隐球菌不被检出。
(4)分离培养（1分）
将标本接种在沙氏培养基上，病原性隐球菌在25℃和37℃生长，而非病原性隐球菌在。
37℃时不生长。培养2—5d后观察菌落形态特点，并取菌落作印度墨汁负染色镜检。(５鉴定（3分）
1）酚氧化酶试验：接种l-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经2～5d培养，呈棕黑色菌落。
2）脲酶试验：能产生脲酶分解尿素琼脂培养基中的尿素形成nh4+和co2，使ph升高，培养基可由黄色变粉红色，而白假丝酵母菌为阴性。
3）糖同化及发酵试验：能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能发酵多糖类，不能同化硝酸盐。非致病性隐球菌不能同化肌醇。
3、如何进行病毒的鉴定，详述病毒鉴定的步骤与方法。参***：
1、初步鉴定（4分）
1)根据临床表现、流行病学特征与标本**，初步判定属于哪一类病毒。(2)根据生物学特性：①细胞病变效应；②血吸附和血凝作用；③干扰现象；(3)病毒的理化特性测定：
①代谢抑制法鉴定病毒核酸类型；②脂溶性试验；③耐酸性试验；
包括病毒核酸型鉴定、耐酸性试验、脂溶剂敏感性试验、耐热性试验、胰蛋白酶敏感试验等。通常以细胞或鸡胚培养为观察体系，应设立已知病毒为对照。
鉴定病毒核酸型：①代谢抑制法，添加氟脱氧尿核苷(fudr)或类似物于病毒培养物中，病毒复制被抑制者，即为dna病毒，否则为rna病毒，也可用dna酶或rna酶分别作用，以判定核酸的性质。绿豆芽酶可降解单股核酸，用它可进一步鉴定核酸是单股或双股。
②可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对其进行鉴定。但技术要求较高。③近年来，pcr核酸测序技术的应用使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。
2、接种动物的观察：根据动物的感染范围，可初步推断属于何种病毒。接种动物的观。
察是非常重要的，通过观察试验动物的反应有时也可初步鉴定何种病毒。每天都需要观察，有时1d需要观察数次。（2分）3、
最终鉴定：病毒的最终鉴定需要免疫学方法、电子显微镜与免疫电子显微镜技术等。
特异性方法加以鉴定。（4分）
1)病毒的血清学鉴定：血清中和试验、血清抑制试验、免疫荧光试验；
病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对分离毒株进行血清学鉴定，以确定病毒的种类、血清型及其亚型。常用的血清学试验有血清中和试验、血清抑制试验等。此外，可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和免疫转印技术分。
析病毒的结构蛋白成分。
2)病毒的分子生物学鉴定：分子生物学技术已广泛应用于病毒的鉴定；包括病毒基因的pcr扩增及其序列分析，核酸杂交技术，病毒全基因组序列测定分析等，从而可获得分离毒株的基因组信息，依据基因组序列绘制遗传进化树分析比较分离毒株的遗传变异情况，确定分离毒株的基因类型。
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